明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠胰岛素受体表达的影响

摘  要

目的:探讨明日叶查尔酮(Ashitabechalcone,AC)对2型糖尿病(2-DM)大鼠肝细胞及红细胞胰岛素受体表达的影响。

方法:将采用小剂量链脲佐菌素(STZ)加高脂饲料饲养方法建立的Wistar大鼠2型糖尿病模型随机分为4组:高、中、低剂量组,分别经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10、5mg/(kg•bw);糖尿病对照组给予等量生理盐水灌胃,各组均喂以高脂饲料;正常对照组为正常大鼠喂以普通饲料。检测肝脏和红细胞胰岛素受体表达及空腹血糖、血清胰岛素等指标。

结果:与正常对照组比较,糖尿病对照组空腹血糖和血清胰岛素水平显著性升高,肝细胞胰岛素受体表达和红细胞胰岛素受体结合位点r1和r2则均降低(P<0.01);高剂量组的血糖水平和血清胰岛素水平均较糖尿病对照组降低,肝细胞胰岛素受体表达和红细胞胰岛素受体结合位点r1和r2则升高(P<0.01),差异均有统计学意义。

结论:明日叶查尔酮可上调2型糖尿病大鼠肝组织和红细胞胰岛素受体表达水平,降低血糖和血清胰岛素水平。

关键词:明日叶查尔酮;2型糖尿病;胰岛素受体

研究地点:山东青岛,青岛大学医学院

明日叶(Angelicakeiskei)是一种原产于日本八丈诸岛的伞形花科多年野生草本芹科植物。查尔酮是明日叶茎和叶子中黄色汁液的主要成分。有研究证明,明日叶查尔酮具有抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病等多种生物活性。2型糖尿病的特征性表现为胰岛素抵抗,而受体数目减少和(或)功能异常与胰岛素抵抗的发生有密切关系。本实验给用Wistar大鼠制备的2型糖尿病模型饲以不同剂量的明日叶查尔酮,检测肝细胞和红细胞上胰岛素受体的表达水平等指标,观察明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠胰岛素受体表达的影响。

1材料与方法

1.1实验动物与饲料健康清洁级雄性Wistar大鼠,60只,体重170±10g,由山东鲁抗实验中心提供。大鼠实验前于本实验室适应性喂养7d。动物的普通和高脂饲料,由中国医学

院实验动物研究所提供。

1.2主要材料

明日叶查尔酮,由青岛海隆达公司提供,经紫外线分光光度法测定其纯度>90%;查尔酮标准品,购于美国Sigma公司,纯度>99%;链脲佐菌素STZ,购自美国Sigma公司;125-碘化钠,美国杜邦公司生产,胰岛素测定试剂及化学发光免疫测定仪,美国DP公司产品,UV-2000紫外分光光度计,尤尼柯仪器有限公司生产,罗氏全活力型血糖仪及配套试纸,德国罗氏公司产品。

1.3实验方法

1.3.1模型制备

将实验动物用高脂饲料喂养4周,分别在第5周的1、3和5天早晨,各空腹腹腔注射STZ25mg/(kg•bw)、15mg/(kg•bw)、15mg/(kg•bw)1次,在末次注射后72h,尾尖取血检测空腹血糖,血糖值≥16.7mmol/L者为造模成功。

1.3.2实验分组

将制备的糖尿病大鼠组分为对照组和明日叶查尔酮高、中、低剂量组,每组10只,均喂饲高脂饲料,其中高、中、低剂量组分别经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10、5mg/(kg•bw),正常对照组为正常大鼠喂饲普通饲料,连续饲养4周。空腹12h尾尖采血测定血糖含量,以7%水合氯醛腹腔注射麻醉,取肝脏组织,腹主动脉采血8mL并分为抗凝和不抗凝两种处理进行指标检测。

1.4检测指标

1.4.1空腹血糖测定

葡萄糖氧化酶法,取微量尾尖血滴于罗康全活力型血糖仪配套试纸上,读取血浆血糖数值。

1.4.2血清胰岛素测定用放射免疫法测定,取血清0.1mL加入沉淀管中,经加入标记物抗体、37℃温育、分离剂、离心等处理后测定沉淀管的放射性计数。根据标准管及非特异性管放射性计数绘制log-logit标准曲线,计算血清胰岛素的含量。

1.4.3肝细胞胰岛素受体蛋白表达测定

应用免疫组化方法测定,将取得的肝组织经过4%甲醛固定,进行石蜡包埋,切片,SABC免疫组化法反应,进行DAB显色,脱水,透明,封片;进行高倍镜观察和利用Image-ProPlus图像软件进行光密度分析。

1.4.4红细胞胰岛素受体测定

采用放射性配体结合分析试剂盒测定;用白细胞分离液(33.9%泛影葡胺和9%Fickll液按1∶2.4体积比混合)将白细胞从全血中除去后,计数红细胞悬液的红细胞数。受体测定反应体系中包括INS标准品50μL,A14-[125I]-单碘INS50μL和红细胞悬液200μL,INS标准品浓度依次为0、1、5、20、80、320、1280ng/mL,液体混匀后固定于振荡器,15℃孵育20h,加入缓冲液及分离剂混匀,离心,弃上清,测定下层细胞的放射性。经Scatchard作图分析求算出高亲和力、低亲和力受体结合容量q1、q2,以q1、q2除以相应的红细胞数量即为每个红细胞的胰岛素受体数目r1、r2。1.5统计处理采用SPSS17.0软件进行统计分析,各试验组与对照组采用单因素方差分析,组间比较采用SNK-q法。检验水准α=0.05。

2结果与分析

2.1血糖、胰岛素含量和红细胞数

与正常对照组比较,糖尿病对照组空腹血糖和胰岛素含量升高(P<0.01),与糖尿病对照组比较,高剂量组空腹血糖和胰岛素含量降低(P<0.01),差异均具有统计学意义。各组的血糖、胰岛素和红细胞测定结果见表1。

明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠胰岛素受体表达的影响

表1 各组血糖、胰岛素和红细胞数量检测结果 ( x± S,n =10)
注:Δ与糖尿病对照组比较,P <0. 01

2.2肝细胞胰岛素受体表达

肝细胞胰岛素受体为细胞膜表达,阳性表达呈现橙黄色颗粒。附图显示,糖尿病对照组呈现阳性表达的细胞数量较正常对照组少,染色浅,为低表达;高剂量组较糖尿病对照组阳性表达的细胞数量多,染色深,表达水平升高。

附图 肝脏组织细胞中IR蛋白表达

附图 肝脏组织细胞中 IR 蛋白表达

经光密度分析,高剂量组与糖尿病对照组的平均光密度值分别为0.402±0.006和0.375±0.010(P<0.01),差异有统计学意义;正常对照组为0.448±0.008,与糖尿病对照组比较差异有统计学意义(P<0.01)。各组大鼠肝脏IR蛋白表达的平均光密度值见表2。

表2 各组大鼠肝脏IR 蛋白表达的平均光密度值

表2 各组大鼠肝脏IR 蛋白表达的平均光密度值
注:Δ与糖尿病对照组比较,P <0. 01

2.3红细胞胰岛素受体的表达水平

糖尿病对照组红细胞的高、低亲和力受体结合位点数r1和r2分别为64.73±0.34、1827.05±55.54,均低于正常对照组(P<0.01);与糖尿病对照组比较,高剂量组r1和r2分别为80.23±0.47、2205.72±67.12,差异均具有统计学意义(P<0.01);各组测定见表3。

表3 各组红细胞受体位点数和结合容量 ( x±S,n =10)

表3 各组红细胞受体位点数和结合容量 ( x±S,n =10)
注:Δ与糖尿病对照组比较,P <0. 01

3讨论

胰岛素受体是一种跨膜蛋白广泛存在多种组织器官上,其中肝脏是胰岛素受体的典型靶器官。肝细胞胰岛素受体对机体葡萄糖的代谢有重要影响作用。红细胞虽然不是胰岛素的靶细胞,但红细胞膜上胰岛素受体数量的增减与其它细胞呈一致关系,对表明组织细胞的葡萄糖代谢利用有较好的代表性。红细胞上胰岛素受体分为高亲和力和低亲和力两种,高亲和力胰岛素受体结合位点r1数目较少,但可以特异性与胰岛素结合迅速发挥作用;低亲和力胰岛素受体结合位点r2与胰岛素结合容量大,反应持久,可反映胰岛素受体的储备能力;有报道,糖尿病患者可能同时伴有胰岛素受体数目减少及结合能力下降。

本实验结果显示,糖尿病对照组空腹血糖和空腹胰岛素水平明显高于正常对照组,表明成功制备2型糖尿病大鼠模型;高剂量组的空腹血糖和空腹胰岛素水平低于糖尿病对照组,说明补充明日叶查尔酮可降低2型糖尿病大鼠空腹血糖和胰岛素水平,改善其胰岛素抵抗和糖代谢。

本实验肝脏和红细胞上胰岛素受体表达水平结果可见,糖尿病对照组的肝细胞胰岛素受体蛋白表达水平及红细胞的胰岛素受体结合位点均低于正常对照组,表明2型糖尿病存在由胰岛素受体数目的减少,胰岛素敏感性下降而引起的胰岛素抵抗。

实验结果还可见,高剂量组的肝脏和红细胞上胰岛素受体的表达水平明显高于糖尿病对照组,并且高剂量组表达水平高于中剂量组和低剂量组,说明补充明日叶查尔酮可以增加2型糖尿病大鼠胰岛素受体表达、增强胰岛素的敏感性,从而降低血糖和血清胰岛素水平。本项结果与文献报道黄酮类化合物能够通过增加靶细胞岛素受体表达改善胰岛素的敏感性,使受体环节的胰岛素信号传导障碍减轻相符合。

综上可以认为,明日叶查尔酮后能提高2型糖尿病大鼠高肝脏和红细胞胰岛素受体表达水平,降低空腹血糖和血清胰岛素,改善2型糖尿病的胰岛素抵抗和糖代谢。

 

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