明日叶查尔酮对小鼠肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响

摘  要

目的:

研究明日叶查尔酮(Ashitabechalcone,AC)对小鼠H22肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响。

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方法:

将50只荷H22肝癌小鼠随机分为AC不同剂量实验组(5、20、40mg/kg),阴性对照组和环磷酞胺(cytoxan,CTX)阳性对照组,共5组,每组10只。AC实验组小鼠每天分别按不同的剂量灌胃,阴性对照组小鼠给予生理盐水灌胃,CTX组隔天腹腔注射CTX20mg/kg,10d后处死小鼠,取瘤组织测定瘤质量、抑瘤率,并采用免疫组化法检测各组小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax蛋白的表达,用MTT法检测各组小鼠肿瘤细胞增殖活性。

结果:

阴性对照组小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax阳性细胞表达率分别为5.00%和4.68%,AC40mg/kg剂量组分别为38.52%和35.76%,均高于阴性对照组(P<0.05);阴性对照组肝癌细胞增殖活性为1.135±0.032,AC40mg/kg剂量组为0.716±0.018,低于阴性对照组(P<0.05)。AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均明显低于阴性对照组(P<0.05)。

结论:

明日叶查尔酮可上调Caspase-3和Bax蛋白的表达且具有抑制肿瘤细胞增殖作用。

关键词:

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明日叶查尔酮,肝癌,Caspase-3,Bax

研究地点:

青岛大学医学院

 

明日叶(Ashitaba)是一种野生芹科植物,原产于日本八丈诸岛,因其生命力顽强,今日摘叶明日可发新芽,故称明日叶。据报道,该植物具有提高机体免疫力、改善睡眠、延缓衰老等多重功效。

有研究证明,明日叶的主要效应成分查尔酮(chalcone),在抗肿瘤、抗氧化等方面作用显著。细胞凋亡与肿瘤的发生发展有非常密切的关系,细胞凋亡减少是肿瘤发生发展的重要因素。Caspase-3是凋亡执行的重要效应分子,Bax是重要的促凋亡蛋白,二者在细胞凋亡的过程中起着关键作用。但目前尚未见明日叶查尔酮对肿瘤细胞Caspase-3和Bax蛋白表达影响方面的研究报道。

本实验采用H22肝癌荷瘤小鼠,通过饲以不同剂量的明日叶查尔酮(Ashitabachalcone,AC),用免疫组化法检测小鼠肿瘤细胞Caspase-3和Bax的表达情况,用MTT法检测小鼠肿瘤细胞增殖活性等,观察AC的抗肿瘤作用。

1材料与方法

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1.1动物和材料

H22肝癌荷瘤种鼠由山东省实验动物中心提供。清洁级健康昆明小鼠50只(雌雄各半),由山东鲁抗医药实验中心提供,6~8周龄,体质量18~20g。小鼠实验前于本实验室适应性喂养7天。明日叶查尔酮由本实验室制备,经紫外分光光度法测定其纯度>90%。查尔酮标准品购于美国Sigma公司,纯度>99%。RPMI1640培养基、胎牛血清、四甲基偶氮唑蓝(MTT)均购自美国Gibc。公司;环磷酞胺(cytoxan,CTX)购于江苏恒瑞医药股份有限公司;Caspase-3,Bax、一抗、二抗和即用型SABC免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。5%二氧化碳培养箱,日本三洋电器有限公司产品;TDL-5离心机,上海安亭科学仪器厂产品;瑞典产R。sysAnth。s2010型双波长酶标仪;日本产。lympusXDS-1B型倒置显微镜;电子天平,上海天平仪器厂产品。

1.2方法

1.2.1动物分组与处理

无菌抽取H22肝癌小鼠腹水,镜下调节肿瘤细胞密度至1×107/ml,制成细胞悬液于小鼠右前肢腋窝处皮下接种,每只0.2ml。肿瘤细胞接种后次日,将50只小鼠随机分为阴性对照组、环磷酞胺组和AC不同剂量实验组(5、20、40mg/kg),每组10只,雌雄各半。3个AC实验组分别经口灌胃给予不同浓度的AC,连续10天。阴性对照组同法给予生理盐水,环磷酞胺组隔日腹腔注射CTX1次(20mg/kg)。于第11天颈椎脱臼处死小鼠,取瘤组织待检。

1.2.2瘤细胞中Caspase-3和Bax蛋白表达的检测

采用SABC免疫组化法,按检测试剂盒说明操作。将瘤组织经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋切片,3%H202消除内源性过氧化物酶,微波修复抗原。按1:50浓度滴加一抗,4℃过夜,滴加二抗,DAB显色,脱水,透明和封片。显微镜下观察Caspase-3和Bax蛋白的表达水平。Caspase-3阳性表达细胞为细胞胞浆中出现棕黄色或褐色颗粒。Bax主要在胞浆表达,呈现棕黄色或褐色颗粒的细胞为阳性表达细胞。每只动物观察500个细胞,计数其中有阳性表达的细胞。按下式计算阳性表达率:

阳性表达率=〔阳性细胞数叶数细胞总数)x100%

1.2.3瘤细胞增殖活性测定

将瘤组织剪碎研磨,经过滤、离心后制成瘤细胞悬液。调节细胞密度为1×106/ml,接种于96孔培养板,每孔100ul,置于5%二氧化碳培养箱中37℃培养16h。用MTT法测定各孔吸光度,各组肿瘤细胞增殖活性用平均吸光度D(490)值表示,并按下列公式计算各组小鼠肝癌细胞增殖活性的抑制率:

抑制率=〔阴性对照组D(490)值-实验组D(490)值〕/阴性对照组D(490)值x100%

1.2.4瘤质量和抑瘤率

用电子天平称量每只动物瘤质量,计算各组平均瘤质量,并按下列公式计算抑瘤率:

抑瘤率=(阴性对照组平均瘤质量-实验组平均瘤质量)/阴性对照组平均瘤质量x100%

1.3统计学方法

采用SPSS17.0统计软件处理数据,计数资料采用了检验,计量资料用单因素方差分析,以α=0.05为检验水准。

2结果

2.1Caspase-3和Bax蛋白表达

结果见表1。

表1明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响

表1明日叶查尔酮对小鼠H22肝癌细胞Caspase-3和Bax蛋白表达的影响

阴性对照组阳性表达的细胞数少且颜色浅淡,呈弱表达(图1A),阳性表达率为5.00%。AC40mg/kg剂量组Caspase-3阳性表达细胞数多且颜色较深,呈强表达(图1B),其阳性表达率为38.52%,明显高于阴性对照组(P<0.05)。

图1肝癌细胞Caspase-3蛋白的表达(DABx400). A:阴性对照组;R:AC 40 mg/kg组

图1肝癌细胞Caspase-3蛋白的表达(DABx400). A:阴性对照组;R:AC 40 mg/kg组

阴性对照组Bax阳性表达的细胞少,染色浅(图2A)。AC40mg/kg组较阴性对照组的阳性表达细胞数多,且染色较深(图2B)。AC40mg/kg组阳性细胞表达率为35.76%,明显高于阴性对照组(4.68%)(P<0.05)。

图2肝癌细胞Bax蛋白的表达(DAB x 400). A:阴性对照组;B:AC 40 mg/kg组

图2肝癌细胞Bax蛋白的表达(DAB x 400). A:阴性对照组;B:AC 40 mg/kg组

2.2肿瘤细胞增殖活性

各组细胞增殖活性测定结果见表2。AC20、40mg/kg剂量组肿瘤细胞增殖活性分别为0.716±0.018和0.834±0.027,均较阴性对照组显著降低(P<0.05)。

表2 各组小鼠癌细胞增殖活性

表2 各组小鼠癌细胞增殖活性

2.3平均瘤质量和抑瘤率

结果见表3。AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均显著低于阴性对照组(P<0.05)。

表3 各组小鼠瘤质量和抑瘤率

表3 各组小鼠瘤质量和抑瘤率

3讨论

明日叶查尔酮属黄酮类化合物,是明日叶的主要功效成分,其化学结构为1,3-二苯基丙烯酮,是植物体内合成黄酮的前体,以它为母体的天然化合物广泛存在于植物界中。有研究证明,从甘草中提取的查尔酮具有抗肿瘤、抗氧化等功效,本实验探讨了从明日叶中提取的查尔酮对小鼠肝癌细胞的影响。

Caspase为天冬氨酸特异性半胧氨酸蛋白水解酶,是一类可介导细胞凋亡的蛋白水解酶。Caspase的活性位点均包含半胧氨酸残基,能够特异性的切割靶蛋白天冬氨酸残基后的肤键,从而造成细胞凋亡。

Caspase-3是Caspase家族中重要的公共凋亡效应因子,其活化在细胞凋亡信号转导过程中起核心作用,是细胞凋亡过程中激活的关键蛋白激酶和主要效应因子。大多数触发细胞凋亡的因素,均需通过Caspase-3介导的信号传导途径导致细胞凋亡。当Caspase-3表达增多时,细胞凋亡加速。

本实验结果显示,AC40、20mg/kg剂量AC组瘤细胞Caspase-3的阳性表达率均高于阴性对照组,说明AC具有引发肿瘤细胞Caspase-3蛋白表达,促进瘤细胞凋亡的作用。该结果与文献中报道的查尔酮具有抗肿瘤作用的结论相一致。

Bax是Bcl-2家族中重要一员,起促凋亡作用。Bax蛋白被激活后将会易位至线粒体外膜,发生寡聚体化,线粒体通透性转变通道开放,线粒体内的细胞色素C进入细胞质,启动线粒体依赖性的凋亡通路,使细胞发生凋亡。当Bax蛋白表达增多时,细胞凋亡加速。

本实验结果中阴性对照组Bax蛋白的阳性表达率低于AC40、20mg/kg剂量组,说明AC可引发肿瘤细胞中Bax蛋白的表达,促进肿瘤细胞凋亡。该结果与前述Caspase-3蛋白表达相吻合。

细胞增殖活性是反映细胞生理状态的基础性指标。本实验结果显示,AC20、40mg/kg剂量组肿瘤细胞增殖活性明显低于阴性对照组,说明AC对H22肝癌细胞增殖有一定抑制作用。

瘤质量是表示肿瘤发展状态的重要指标。结果显示,AC20、40mg/kg剂量组平均瘤质量均低于阴性对照组,提示AC具有抑制肝癌细胞生长的作用。两项结果均与上述Caspase-3和Bax的测定结果相吻合。

综上,明日叶查尔酮能降低小鼠H22肝癌细胞的增殖活性,提高Casepase-3和Bax蛋白表达水平,具有抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡的作用。

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明日叶

明日叶,一个植物学家,一个地地道道的农民,热爱大自然,追求自然之道,从十年前开始专注高端明日叶引进、种植与研发,分享有关明日叶的资料及个人经验感悟。

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