明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠肝脏和骨骼肌葡萄糖转运体表达的影响

研究地点:青岛大学医学院公共卫生系,青岛

摘   要

目的:

研究明日叶查尔酮对2型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖转运体2(Glut2)和骨骼肌葡萄糖转运体4(Glut4)蛋白表达的影响。

方法:

制造2型糖尿病大鼠模型,随机分成高、中、低剂量组和糖尿病对照组,分别每日灌胃给予30、10、5和0mg/kgBW明日叶查尔酮。各组以高脂饲料喂养4周后,用葡萄糖氧化酶法检测空腹血糖;放射免疫法检测血清胰岛素含量;免疫组化法检测葡萄糖转运体蛋白表达水平。

结果:

经图像分析,高剂量组肝脏和骨骼肌葡萄糖转运体蛋白表达平均光密度值分别为(0.036±0.0030)和(0.063±0.0139),均较糖尿病对照组显著升高(P<0.05)。高剂量组空腹血糖和胰岛素水平分别为(12.3±1.64)mmol/L和(25.65±3.34)μIU/ml,均较糖尿病对照组显著性降低(P<0.05)。

结论:

明日叶查尔酮可上调2型糖尿病大鼠肝脏葡萄糖转运体2和骨骼肌葡萄糖转运体4蛋白表达水平,降低空腹血糖和胰岛素水平,改善糖尿病胰岛素抵抗状况。

关键词:明日叶查尔酮;2型糖尿病;葡萄糖转运体

 

明日叶(Angelicakeiskei)又名碱草,原产于日本八丈诸岛,属伞形科多年生草本植物。查尔酮(chalcone)是一种含有1,3-二苯基丙烯酮结构的黄酮类化合物,是明日叶的主要活性成分,在明日叶的根、茎中含量较为丰富。有究表明,明日叶查尔酮(Angelicakeiskeichalcone,AC)具有抗糖尿病、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学功效。

本实验采用给2型糖尿病大鼠模型口服AC的方法,观察了其对2型糖尿病大鼠肝脏和骨骼肌葡萄糖转运体蛋白表达的影响。

1材料与方法

1.1主要材料

1.1.1实验动物和饲料清洁级健康雄性Wistar大鼠,许可证号:scxk(鲁)20090007,体重(170±10)g,由山东鲁抗医药实验中心提供。实验动物于本实验室适应性喂养一周进行实验。高脂饲料和普通饲料购自中国医学科学院实验动物研究所。

1.1.2明日叶查尔酮实验样品由青岛某公司提供,采用有机溶剂浸提法提取,经紫外分光光度法测定,含量大于90%,查尔酮标准品由美国Sigma公司提供。

1.1.3试剂和仪器链脲佐菌素(streptozocin,STZ)购自sigma公司(批号:S0130);胰岛素放免试剂盒购自北京北方生物技术研究所(批号:20111220),葡萄糖转运蛋白免疫组化试剂盒及兔抗鼠多克隆抗体均购自北京博奥森生物技术有限公司(批号:lot999805w;lot909091w;862150Ainvitrogen);血糖仪及试纸、显微镜、照相机均为OLYMPUS公司产品。

1.2实验方法

1.2.12型糖尿病大鼠模型制备将实验动物用高脂饲料喂养,4周后腹腔注射STZ。检测空腹血糖,血糖值>16.7mol/L者为造模成功。

1.2.2动物分组与处理将造模成功的糖尿病大鼠参照血糖随机分成高、中、低查尔酮剂量组和糖尿病对照组,每组10只,均喂饲高脂饲料,分别每天经口灌胃给予明日叶查尔酮的剂量为30、10、5、0mg/kgBW,正常对照组为正常大鼠喂饲普通饲料,连续饲喂4周。空腹12h,以10%水合氯醛腹腔注射麻醉,腹主动脉取血并分离血清,取肝脏和股四头肌标本,检测各项指标。

1.3检测指标

1.3.1肝脏Glut2和骨骼肌Glut4蛋白表达采用免疫组化法测定。分别取肝脏和股四头肌标本,经4%多聚甲醛固定,石蜡包埋,切片,烤片,脱蜡,脱水,阻断灭活内源性过氧化物酶,抗原修复,封闭,滴加一抗(肝脏标本Glut2兔抗鼠多克隆抗体,骨骼肌标本Glut4兔抗鼠多克隆抗体)和二抗,DAB反应染色,苏木素复染,脱水,透明,干燥,封片,高倍显微镜下随机选取视野观察Glut2和Glut4蛋白表达水平,并采用Image-ProPlus图像软件进行光密度分析,每只动物分析2个视野,各组的表达水平以平均光密度值表示。

1.3.2血清胰岛素含量采用放射免疫法测定。取血清0.1ml,加入抗体、37℃温育、加分离剂、室温静置、离心等处理后测定沉淀管的放射性计数。测定并依据放射性计数绘制log-logit标准曲线,计算出血清胰岛素含量。

1.3.3血糖采用葡萄糖氧化酶法测定。尾尖取血滴于血糖仪配套试纸上,读取血糖仪上显示的数据。

1.4统计处理

采用SPSS18.0软件对计量资料进行单因素方差分析后,采用Bonferroni法,以α=0.05为检验水准进行显著性检验。

 

2结果

2.1Glut2蛋白表达水平Glut2蛋白主要表达于细胞质,呈棕黄色颗粒。本试验肝脏Glut2蛋白呈现高剂量组阳性细胞数目多,染色深,为高度表达(图1)。高剂量组与糖尿病对照组平均光密度值分别为(0.036±0.0030)和(0.014±0.0048),差异有显著性(P<0.05)。各组Glut2蛋白表达平均光密度(MOD)值见表1。

图 1 肝组织细胞中 Glut2 蛋白的表达( DAB × 400)

图 1 肝组织细胞中 Glut2 蛋白的表达( DAB × 400)

表 1 各组大鼠肝脏 Glut2 和骨骼肌 Glut4蛋白表达水平( MOD 值)

表 1 各组大鼠肝脏 Glut2 和骨骼肌 Glut4蛋白表达水平( MOD 值)
注: ( 1) 与正常对照组比较,P < 0. 05; ( 2) 与中剂量组比较,P < 0. 05; ( 3) 与糖尿病对照比较,P < 0. 05; FGlut2=76. 558 ,FG lut4= 42. 7022. 2 Glut4 蛋白

2.2Glut4蛋白表达水平Glut4蛋白主要表达于细胞质,呈棕黄色颗粒。本试验骨骼肌Glut4蛋白呈现高剂量组阳性细胞数目多,染色深,为高度表达(图2)。高剂量组与糖尿病对照组平均光密度值分别为(0.063±0.0139)和(0.018±0.0087),差异有显著性(P<0.05)。各组Glut4蛋白表达平均光密度(MOD)值见表1。

图 2 骨骼肌组织细胞中 Glut4 蛋白的表达( DAB × 400)

图 2 骨骼肌组织细胞中 Glut4 蛋白的表达( DAB × 400)

2.3空腹血糖与空腹胰岛素含量与糖尿病对照组比较,高剂量组空腹血糖和空腹胰岛素水平均降低,且差异有统计学意义(P<0.05)。各组测量结果见表2。

表 2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素检测结果

表 2 各组大鼠空腹血糖、胰岛素检测结果
注: ( 1) 与正常对照组比较,P < 0. 05; ( 2) 与中剂量组比较,P < 0. 05; ( 3) 与糖尿病对照 组比较,P < 0. 05; F血糖= 127. 227,F胰岛素= 205. 713

3讨论

有文献报道明日叶查尔酮具有降低糖尿病氧化应激和血糖水平、改善胰岛素抵抗等作用,也有学者研究发现,明日叶查尔酮可通过活化过氧化物酶体有活性的增殖子感受器-c表现出胰岛素样活性。

本次试验结果可见,糖尿病对照组的空腹血糖和胰岛素水平高于正常对照组,高剂量组的空腹血糖和胰岛素水平则低于糖尿病对照组,表明明日叶查尔酮可降低2型糖尿病大鼠血糖和胰岛素水平,改善胰岛素抵抗。糖尿病的重要表现为胰岛素抵抗,此时骨骼肌、肝脏和脂肪组织等外周组织对胰岛素敏感性降低,葡萄糖的摄取、利用减少。在这些外周组织细胞中转运葡萄糖的是葡萄糖转运体。葡萄糖转运体(Gluts)是一个蛋白家族,目前已经鉴定了14种亚型,每种在组织细胞中的表达及其动力学性质均不同。肝脏最主要的葡萄糖转运体是Glut2,在肝细胞中Glut2与胰岛素受体(IR)形成复合物而发挥作用。当Glut2表达和功能受影响时,可发生肝脏对葡萄糖摄取和利用不足,胰岛素介导的糖代谢异常。

本次实验结果表明,糖尿病对照组肝脏Glut2蛋白表达水平均较正常对照组显著性降低,而高剂量组则均较糖尿病对照组显著性升高,且呈现其作用随剂量增加而增大的剂量效应关系,说明明日叶查尔酮可增加2型糖尿病大鼠肝脏Glut2蛋白的表达,进而增强葡萄糖由血液到肝细胞内的转运和肝糖原合成,使血糖浓度降低。Glut4主要分布于骨骼肌细胞内,在餐后和运动时,Glut4转运葡萄糖的速率大幅提高。Glut4为胰岛素敏感的葡萄糖载体。胰岛素与细胞外膜上的胰岛素受体结合,经过一系列信号使细胞内含有Glut4的囊泡移动到细胞膜并与之融合,使膜表面Glut4含量猛增,大幅提高葡萄糖的转运,维持血糖稳态。

本次实验结果显示,高剂量组骨骼肌Glut4蛋白表达水平较糖尿病对照组显著性升高,表明明日叶查尔酮可提高2型糖尿病大鼠骨骼肌Glut4蛋白的表达。综合本次实验结果可以认为,明日叶查尔酮可降低2型糖尿病大鼠血糖和血清胰岛素水平,改善胰岛素抵抗,其调节机制可能与明日叶查尔酮可上调肝脏Glut2和骨骼肌Glut4表达水平,从而增强了血液中葡萄糖向肝脏和骨骼肌细胞内转运有关。

 

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