明日叶查尔酮对糖尿病大鼠肝细胞PI3K和AktmRNA表达的影响

研究地点:青岛大学医学院营养研究所,青岛

摘    要

目的

研究明日叶查尔酮(ashitabechalcone,AC)对糖尿病大鼠肝细胞磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidyIinositol3-kinase,PI3K)和蛋白激酶(serine-threoninekinases,Akt)mRNA表达的影响。

方法

高脂饲料喂养加链尿佐菌素腹腔注射诱发的2型糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组,每组10只,均喂饲高脂饲料,分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮0、30和10mg/kgBW。另设一个正常对照组为正常大鼠喂饲普通饲料,实验周期4周。用放射免疫分析法检测血清胰岛素水平,葡萄糖氧化酶法测血糖含量,逆转录聚合酶链式反应方法检测肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平,蛋白印迹法测肝细胞Akt磷酸化水平。

结果

高剂量AC组空腹血糖和血清胰岛素水平显著低于糖尿病对照组,而PI3KmRNA、AktmRNA和磷酸化Akt蛋白表达水平均显著高于糖尿病对照组,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

结论

明日叶查尔酮可上调糖尿病大鼠PI3K和AktmRNA的表达水平,改善胰岛素抵抗。

 

关键词:明日叶查尔酮磷脂酰肌醇3激酶蛋白激酶Akt胰岛素抵抗

 

PI3K/Akt信号通路是胰岛素受体后信号转导的关键途径,是激活葡萄糖转运体,促进糖原合成和葡萄糖转运的关键效应分子。Akt磷酸化及PI3K与Akt表达降低,可导致胰岛素受体后的信号转导障碍,从而发生胰岛素抵抗。明日叶是原产于日本八丈岛的野生芹科植物,查尔酮(chalcone)是明日叶(Angelicakeiskei)的主要功效成分。

有研究报道,明日叶查尔酮(ashitabechalcone,AC)具有抗氧化、降血糖、改善胰岛素抵抗等有良好生物活性。本研究给高脂饲料喂养+链尿佐菌素所致的糖尿病大鼠口服AC,探讨了AC对糖尿病大鼠Akt磷酸化、PI3K和AktmRNA表达和胰岛素抵抗的影响。

1材料与方法

1.1实验动物和饲料

清洁级健康雄性Wistar大鼠(山东鲁抗医药实验中心提供),6~8周龄,体重180~200g,许可证号:SCXK(鲁)2009-2007,合格证号:0013862,在本实验室适应性喂养7d后用于实验(动物房室温25℃,相对湿度50%,光照度150lx)。高脂饲料(10.0%猪油,20.0%蔗糖,2.5%胆固醇,1.0%胆酸盐,66.5%常规饲料),由北京华阜康生物科技股份有限公司提供。

1.2实验样品

明日叶查尔酮由本实验室制备,经紫外分光光度法测定含量>90%。查尔酮标准品购于美国Sigma公司。

1.3试剂和仪器

链尿佐菌素(STZ),美国Sigma公司;血清胰岛素放射免疫测定试剂盒,天津九鼎医学生物工程有限公司;RNA抽提试剂盒,天根生化科技有限公司;兔InsR多克隆抗体,美国Neomarkers公司;SP试剂盒,迈新生物技术开发有限公司;DYY-7C型电泳仪,北京六一仪器厂;凝胶成像系统,上海韵涵生物科技有限公司;紫外分光光度计UV-2000,龙尼柯仪器有限公司;台式高速冷冻离心机TGL-16,湘仪离心机公司。

1.4造模及分组

实验动物在本实验室适应性饲养1周后,随机取10只设为正常对照组,饲以基础饲料。其余动物用高脂饲料喂养3周后,连续3d腹腔注射小剂量STZ(25mg/kg),继续高脂饲料喂养,一周后测定空腹血糖大于11.1mmol/L为造模成功大鼠。参照血糖水平将成模大鼠随机分为糖尿病对照组和高、低剂量AC组,每组10只,均饲以高脂饲料。高、低剂量AC组分别每日经口灌胃给予明日叶查尔酮30、10mg/kg,正常对照组和糖尿病对照组则给予蒸馏水。实验4周后,全部动物禁食12h后,水合氯醛麻醉,腹主动脉取血,分离血清检测血糖和胰岛素水平,取肝组织置-80℃冷冻备检肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平及肝细胞Akt磷酸化水平。

1.5空腹血糖和血清胰岛素水平测定

血清胰岛素水平用放射免疫分析法检测,血糖含量用葡萄糖酶氧化法测定,并根据公式计算胰岛素抵抗指数(HOMA-IR):胰岛素抵抗指数=空腹胰岛素×空腹血糖/22.5。

1.6肝细胞PI3K和AktmRNA表达水平测定

取肝组织用Trizol试剂提取大鼠肝脏总RNA并测定纯度后,在逆转录酶(MLV)催化下合成cDNA,以适量cDNA为模板在TaqDNA聚合酶催化下进行PCR扩增。

磷脂酰肌醇3激酶基因上下游引物:

5′-AGCATCCCCTCCGTGCCCAA-3’和5′-GAAGGCGGGGGAGGGGAGAG-3’,扩增片段为333bp;

蛋白激酶B基因上下游引物:

5′-AAACCTGGCGGCCACGCTAC-3’和5′-TTGGCCAGGGCCACCTCCAT-3’,扩增片段为361;

GAPDH为内参照,其上下游引物:

5′-TCTCCGCCCCTTCCGCTGAT-3’和5′-CCACAGCCTTGGCAGCACCA-3’,扩增片段为291bp。

所用引物均由上海生工生物公司合成。胰岛素受体基因的扩增条件:预变性95℃,2min后,进入循环,95℃20s、59℃25s、72℃30s,45个循环后72℃延长5min。将PCR产物在2%琼脂糖凝胶中进行电泳,置于MUVB.20凝胶图像分析系统进行吸光度扫描,以GADPH为内参照,用目的基因的吸光度与GAPDH吸光度的比值代表目的基因的相对表达含量。

1.7肝细胞磷酸化Akt蛋白表达测定

用Western-blot法检测肝细胞磷酸化Akt表达。取肝组织100mg置于离心管中,加入RIPA900μl,冰浴匀浆后立即加入PMSF100μl,转移至1.5ml离心管中加入Complete液40μl,40℃离心10000r/min,10min,取上清液紫外法测定蛋白含量后。取含30μg总蛋白的上清液进行12%SDS-PAGE电泳。停止电泳后于4×100V条件下转膜1h,然后用脱脂奶粉37℃封闭1h,充分洗膜后加相应稀释的一抗溶液(磷酸化Akt按1∶500稀释、GADPH按1∶2000稀释)4℃孵育过夜,洗膜后加入HRP酶标二抗,37℃与PVDF膜共同孵育杂交1h,洗膜后将杂交膜与感光胶片在暗室内曝光显示各蛋白条带,GAPDH蛋白表达量为内对照,用凝胶成像及分析系统分析各组蛋白显色的密度值并计算各组Akt/GAPDH值。

1.8统计处理

实验数据以x±s表示,采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析,并同时进行LSD比较,以P<0.05为具有统计学意义。

 

2结果

2.1血糖、血清胰岛素及HOMA-IR的比较

由表1可见,糖尿病对照组血糖、胰岛素水平和HOMA-IR均高于正常对照组,高剂量AC组则低于糖尿病对照组,差异均有显著性(P<0.05)。

表 1 各组血糖、胰岛素、HOMA-IR 水平

表 1 各组血糖、胰岛素、HOMA-IR 水平
注: ( 1) 与正常对照组比,P < 0. 05; ( 2) 与糖尿病对照组和 AC 低剂量组比,P < 0. 05

2.2各组PI3K和AktmRNA表达水平

由表2可见,糖尿病对照组的PI3K和AktmRNA表达水平均显著低于正常对照组(P<0.05)。高剂量AC组的PI3K和AktmRNA表达水平均高于糖尿病对照组,差异有显著性(P<0.05)。电泳图谱见图1。

表 2 各组 PI3K 和 Akt m RNA 表达水平

表 2 各组 PI3K 和 Akt m RNA 表达水平
注: ( 1) 与正常对照组比,P < 0. 05; ( 2) 与糖尿病对照组和 AC 低剂量组比,P < 0. 05

图 1 PI3K、Akt m RNA 的电泳图谱

图 1 PI3K、Akt m RNA 的电泳图谱

2.3各组磷酸化Akt表达正常对照组和糖尿病对照组的Akt/GAPDH值分别为1.47±0.28和0.68±0.14。糖尿病对照组磷酸化Akt蛋白表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)。AC高剂量组Akt/GAPDH值为1.34±0.26,高于糖尿病对照组,差异有统计学意义(P<0.05)(图2)。

图 2 各组肝细胞 Akt 磷酸化的 western 结果

图 2 各组肝细胞 Akt 磷酸化的 western 结果

3讨论

本研究中糖尿病对照组的血糖、血清胰岛素和胰岛素抵抗指数均显著性高于正常对照组(P<0.05),说明成功诱发了糖尿病大鼠模型,存在胰岛素抵抗。AC高剂量组的血糖和血清胰岛素水平均低于糖尿病对照组,说明AC可降低2型糖尿病血糖水平,改善胰岛素抵抗。PI3K/Akt信号通路为胰岛素受体通路的主要下游信号通路,其中PI3K、Akt是胰岛素信号向调节葡萄糖转运方向转导的关键蛋白。PI3K是一类特异性的催化磷脂酰肌醇(PI)3位羟基磷酸化,产生具有第二信使作用的激酶。Akt是PI3K的下游分子,主要负责由PI3K始动的生物信息的转导。磷酸化是Akt激活的主要机制,活化的Akt可促进糖原合成和葡萄糖转运,是胰岛素最终发挥效应的关键分子。

本研究结果显示,糖尿病对照组PI3KmRNA、AktmRNA与Akt磷酸化水平均显著低于正常对照组(P<0.05),说明存在胰岛素信号转导障碍。这与文献报道的在高脂饲料喂养的ob/ob小鼠(2型糖尿病鼠)肝细胞中PI3K表达量和活性较正常低50%以及糖尿病SD大鼠骨骼肌Akt蛋白表达和磷酸化水平均降低相一致。

分析各AC组结果显示,高剂量AC组PI3KmRNA、AktmRNA、磷酸化Akt水平明显高于糖尿病对照组(P<0.05),而其血糖、血清胰岛素、胰岛素抵抗指数则显著低于糖尿病对照组(P<0.05),并且高剂量组的改善作用显著大于低剂量组,表明AC具有上调2型糖尿病大鼠的PI3KmRNA和Akt的mRNA与磷酸化表达水平,逆转PI3K/Akt信号通路信号转导障碍,改善2型糖尿病的胰岛素抵抗作用。本结果与HIROMU等报道的结果相一致。

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