HPLC-PDA法测定明日叶不同部位中的4-羟基德里辛和黄色当归醇含量

作者单位：

• 上海海洋大学食品学院，上海
• 上海市园林科学研究所，上海
• 宜宾学院化学与化工学院，四川 宜宾
• 上海交通大学农业与生物学院，上海

摘     要

采用高效液相色谱配备光电二极管阵列检测器法测定明日叶根、茎和叶中4 – 羟基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）和黄色当归醇（xanthoangelol，XAG）的含量。样品分析选用Halo C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm），流动相为0.1%甲酸（A）-甲醇（B）溶液，梯度洗脱，流速为0.3 mL/min，检测波长为370 nm，柱温为40 ℃。4-HD、XAG在0.945～18.900、1.048～20.960 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好，样品含量的相对标准偏差分别为3.13%、2.52%，方法的重复性好，平均回收率分别为103.70%、103.05%。

经检测明日叶中4-HD的分布规律为：茎（149.16 μg/g）＞根（122.42 μg/g）＞叶（1.24 μg/g）；XAG的分布规律为：根（144.28 μg/g）＞茎（75.17 μg/g）＞叶（1.21 μg/g）。4-HD和XAG在根和茎中的分布显著高于其在叶中的分布。

关键词：明日叶；4-羟基德里辛；黄色当归醇；高效液相色谱配备光电二极管阵列检测器

英文摘要（Abstract）

Determination of 4-Hydroxyderricin and Xanthoangelol in Different Parts of Angelica keiskei by HPLC-PDA

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;Shanghai Institute of Landscape Gardening Science, Shanghai 200232, China;College of Chemistry and Chemical Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China;School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Abstract: In this study, the contents of 4-hydroxyderricin (4-HD) and xanthoangelol (XAG) in roots, stems and leaves of Angelica keiskei were determined using high performance liquid chromatography with photo-diode array (HPLC-PDA) detector. The samples were separated on a Halo C18-column (4.6 mm × 150 mm, 2.7 μm), gradiently eluted with 0.1% formic acid in water (A) and methanol (B) at a flow rate of 0.3 mL/min and detected at 370 nm. The column temperature was set at 40 ℃. Good linear relationships between peak area and injection amount of 4-HD and XAG were established within the range of 0.945–18.900 and 1.048–20.960 μg/mL, respectively. The relative standard deviations (RSDs) of peak area for the two compounds were 3.13% and 2.52%, respectively, suggesting good reproducibility of the developed method. The average recoveries of the spiked compounds were 103.70%, and 103.05%, respectively.

The results showed that the distribution of 4-HD in different parts of Angelica keiskei was ranked in decreasing order as follows: stems (149.16 μg/g) > roots (122.42 μg/g) > leaves (1.24 μg/g), while the order of XAG content was as follows: roots (144.28 μg/g) > stems (75.17 μg/g) > leaves (1.21 μg/g). The contents of 4-HD and XAG in roots and stems of Angelica keiskei were significantly higher than in leaves.

Key words: Angelica keiskei; 4-hydroxyderricin (4-HD); xanthoangelol (XAG); high performance liquid chromatography

with photo-diode array (HPLC-PDA)

 

明日叶（Angelica keiskei）是原产于日本伊豆、八丈岛的一种药食兼用的蔬菜，属水芹科多年生草本植物，因今日采摘明日即可发芽而得名[1-3]。

20世纪90年代从日本引进我国，现在逐步发展扩大。明日叶中含有20多种具有生理活性的查尔酮、香豆素类、黄酮类物质，其中4-羟基德里辛（4-hydroxyderricin，4-HD）和黄色当归醇（xanthoangelol，XAG）是明日叶中以苷元形式存在的重要的查尔酮类物质[4-5]，具有特殊的抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗血栓等多种生物活性和药用价值，在植物中非常罕见，其化学结构式如图1所示[6-8]。

植物中不同次生代谢产物的分布和积累是有差异的，了解植物体内有效成分含量的分布对药用植物的栽培、采收及开发可以提供指导[9]。然而目前关于明日叶中活性成分4-HD和XAG在明日叶中不同部位（根、茎和叶）的含量差异分析鲜见报道。

本实验采用高效液相色谱配备光电二极管阵列（high performance liquid chromatography with photo-diode array，HPLC-PDA）法测定明日叶根、茎、叶3 个部位中4-HD和XAG的含量，为明日叶的开发和利用提供数据基础[10-11]。

 

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

明日叶，采自上海交通大学七宝校区明日叶种植基地，采集时间为2014年11月。样品分装后在－20 ℃条件下保存。

4-HD和XAG标准品（纯度均大于98%） 中国科学院上海药物研究所天然产物化学研究室；甲醇（色谱纯） 国药集团化学试剂有限公司；其他溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HPLC仪（PDA检测器及Chromquest色谱工作检测站） 美国Thermo Fisher Surveyor公司；Scout-SE型电子天平 奥豪斯仪器常州有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司；BCD-189JB-S型冰箱 上海夏普电器有限公司；KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司；HH-S型数显恒温水浴锅 金坛市岸头国瑞实验仪器厂；TGL-16M高速台式离心机 上海卢湘仪器有限公司；FD-1A-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司；HK-02A型100 g手提式粉粹机 广州旭朗机械设备有限公司；RE-52C型旋转蒸发器水浴槽 上海青浦沪西仪器厂；DC-2006型低温恒温槽 上海比朗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

准确称取4-HD、XAG各0.945、1.048 mg，分别置于5 mL容量瓶，加甲醇至刻度，超声溶解得对照品储备液。各吸取1 mL对照品储备液，配成混合对照品储备液。分别准确吸取混合对照品储备液200、150、100、50、10 μL置于1 mL容量瓶中，加甲醇定容，摇匀，配制成一系列混合对照品工作溶液[12]。

1.3.2 供试品溶液制备

明日叶清洗干净，剪切分为叶子、茎干、树根3 个部分，置于－4 ℃条件下冷冻24 h，然后真空冷冻干燥22 h，粉碎，过100 目筛[13-14]，得到干燥粉末。按1∶10（g/mL）将样品粉末与体积分数50%乙醇溶液混合，37 ℃水浴加热浸取3 h，冷却到室温，收集乙醇浸取液，按上述方法再浸取样品一次，合并的乙醇浸取液减压回收，至无醇味得到流浸膏。加入8 倍流浸膏质量的去离子水，乙酸乙酯萃取水溶液中目标物质，直至乙酸乙酯萃取液近于无色。合并乙酸乙酯溶液于圆底烧瓶中，在31 ℃、0.1 MPa条件下进行旋转蒸发去除乙酸乙酯，即得样品粗品，保存备用[15-18]。

用甲醇将适量的样品粗品定容至1 mL，超声混匀，过0.45 μm滤膜，备用。

1.3.3 色谱条件

Halo C18色谱柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相：0.1%甲酸溶液（A）-甲醇（B），梯度洗脱程序如下：0～2 min，30% A；2～40 min，30～0% A；40～45 min，0% A；45.0～45.1 min，0～30% A；45.1～50.0 min，30% A。流速0.3 mL/min；柱温40 ℃；检测波长370 nm；进样量5 μL；检测时间50 min。

1.3.4 HPLC-PDA方法学考察

1.3.4.1 精密度实验

精密吸取混合对照品工作溶液（C4-HD=9.45 μg/mL、CXAG=10.48 μg/mL）5 μL，重复进样5 次，分别得到5 个峰面积，进行精密度实验测定。

1.3.4.2 重复性实验

取样品6 份，照1.3.2节方法平行制备，分别进样测定，计算重复性。

1.3.4.3 加样回收率实验

精密称取已知含量的样品适量共5 份， 分别加入混合对照品储备液（C4-HD=94.5 μg/mL、CXAG=104.8 μg/mL）100 μL，按供试品溶液的测定方法处理，测定峰面积，分别计算加样回收率。

1.3.5 样品含量测定

根据4-HD和XAG的HPLC色谱峰面积，依据下式分别可以算出样品中4-HD和XAG的含量。

式中：A为4-HD或XAG的含量/（μg/g）；C样为根据标准曲线得出的被测样品中4-HD或XAG的质量浓度/（μg/mL）；V定为样品最终定容体积/mL；M为试样质量/g；F为稀释倍数。

 

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

对4-HD和XAG的混合对照品储备液在HPLC-PDA中进行分离并且扫描，在波长370 nm处有最大吸收显示，故本实验以370 nm作为扫描波长。

2.2 样品溶剂的选择

提取溶剂一般有甲醇、乙醇、正己烷等，但是甲醇、正己烷等对人体有害。乙醇可有效降低查尔酮酶的活性[19-21]，故选择体积分数50%乙醇溶液作为第1步的萃取剂。根据水沉原理，利用体积分数50%乙醇溶液，可减少提取液中淀粉、蛋白质、黏质等成分的浸入，回收

乙醇后，加水静置处理，可除去溶液中的树脂、脂溶性色素，除去杂质及沉淀[22]。目标物的极性较小，根据相似相容原理，故用乙酸乙酯从溶液中萃取目标物[23]。

2.3 HPLC-PDA方法学考察结果

按照1.3.4节实验方法测定，分别可得4-HD峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为0.85%，XAG峰面积的RSD为0.93%，表明该方法精密度良好；4-HD含量的RSD为3.13%，XAG含量的RSD为2.52%，表明重复性良好；4-HD的平均回收率为103.70%，XAG的平均回收率为103.05%，RSD均小于2%。说明本实验中的HPLC-PDA方法完全适用于样品的测定。

2.4 线性关系分析

将1.3.1节制备的一系列混合对照品工作溶液，在1.3.3节所述色谱条件下进行峰面积测定，以质量浓度C（μg/mL）为横坐标（X），峰面积S为纵坐标（Y）进行线性回归分析，绘制标准品的标准曲线。4-HD的回归方程为Y=305 439X＋1 417 954，R2=0.999 2；XAG的回归方程为Y=288 515X＋1 492 839，R2=0.999 3。

结果表明4-HD、XAG在0.945～18.900、1.048～20.960 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。混合对照品工作溶液（C4-HD=9.450 μg/mL、CXAG=10.480 μg/mL）色谱图见图2，4-HD和XAG 2 个峰之间的分离度为1.8，表明本实验的色谱条件完全适用于4-HD和XAG的分离和检测，且分离效果良好。

图 2   混合对照品工作溶液HPLC色谱图

Fig.2   HPLC chromatogram of standard mixture

2.5 样品中4-HD和XAG的含量测定

按1.3.3节所述色谱条件进行供试品溶液的测定，在波长370 nm处记录明日根、茎、叶的HPLC图，见图3。

（A.明日叶根提取物；B.明日叶茎提取物；C.明日叶叶提取物）

图 3   明日叶样品HPLC色谱图

Fig.3   HPLC chromatograms of Angelica keiskei extracts

 

计算样品中4-HD和XAG含量，并对含量进行对比分析，明日叶不同部位中4-HD和XAG的含量测定结果见表1。

表 1 明日叶不同部位中4-HD和XAG的含量 Table 1 Contents of 4-HD and XAG in different parts of Angelica keiskei
部位	4-HD含量/（μg/g）	XAG含量/（μg/g）
叶	1.24±0.04	1.21±0.03
茎	149.16±3.94	75.17±2.12
根	122.42±3.84	144.28±3.56

 

2.6 不同部位4-HD和XAG含量比较

明日叶各部位均含有4-HD和XAG，且各部位之间差异较大，4-HD主要分布在茎中。明日叶各部位4-HD的含量依次为：茎（149.16 μg/g）＞根（122.42 μg/g）＞叶（1.24 μg/g）。根、茎与叶这3 个部位之间4-HD的含量差异显著。茎中4-HD的含量最高，是根、叶含量的1.2～120.3 倍。

明日叶中X A G 含量的分布规律依次为： 根（144.28 μg/g）＞茎（75.17 μg/g）＞叶（1.21 μg/g），和4-HD的分布特点有所不同。根、茎、叶这3 个部位之间含量差异更明显，尤其根中XAG含量最高，是茎、叶的1.9～119.2 倍。

这3 个部位中，根和茎干中的4-HD和XAG的含量显著大于叶中的含量，茎干中4-HD（149.16 μg/g）的含量与根中（122.42 μg/g）的含量差值为26.74 μg/g，远小于明日叶根中XAG（144.28 μg/g）的含量与茎干（75.17 μg/g）的差值69.11 μg/g。且明日叶根中4-HD和XAG的含量都比较高，故从经济实际角度考虑，明日叶根比茎干在提取、利用4-HD和XAG方面更具有利用价值。

 

3 结 论

本实验在流动相为体积分数0.1%甲酸溶液和甲醇溶液，梯度洗脱、流速为0.3 mL/min、检测波长为370 nm、柱温为40 ℃的HPLC条件下，考察了明日叶植株不同部位（根、茎和叶）中4-HD和XAG含量分布情况。4-HD和XAG在明日叶的根部和茎部分含量较高，而其在叶片部分含量很低。

4-HD在茎部的含量大于根部，但两者之间的差异性不大，XAG在根部的含量明显大于其茎部，相比而言，根中4-HD和XAG这2 种物质含量都较高，更有实际利用价值。这表明明日叶植株不同部位的4-HD和XAG的代谢累积不均匀，具有部位选择性。该研究将对明日叶的不同部位合理开发利用提供理论依据。

参考文献

[1] 陈思婷, 覃伟权, 冯美利, 等. 绿色保健蔬菜长寿芹[J]. 中国热带农业, 2007(1): 43. DOI:10.3969/j.issn.1673-0658.2007.01.023.

[2] 韩曙, 张云逸, 张宏, 等. 珍稀蔬菜: 明日叶[J]. 长江蔬菜, 2002(2): 11.

[3] 韩嘉义. 长寿菜-明日叶[J]. 植物杂志, 2001(4): 16.

[4] 周先丽, 梁成钦, 徐庆, 等. 明日叶的化学成分[ J ] . 中国实验方剂学杂志, 2 0 1 2 , 1 8 ( 3 ) : 1 0 3 – 1 0 5 . D O I : 1 0 . 3 9 6 9 /j.issn.1005-9903.2012.03.032.

[5] TOSHIYUKI N, TAKAHIRO T, KYUICHI K, et al. Absorption and metabolism of 4-hydroxyderricin and xanthoangelol after oral administration of Angelica keiskei (Ashitaba) extract in mice[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics, 2012, 521(1/2): 71-76. DOI:10.1016/j.abb.2012.03.013.

[6] 侯芳霖, 钟进义, 张燕. 明日叶查尔酮对荷瘤小鼠抗氧化能力影响作用的研究[J]. 世界中西医结合杂志, 2011, 6(4): 288-290. DOI:10.3969/j.issn.1673-6613.2011.04.005.

[7] TOSHIHIRO A, HARUKUNI T, MOTOHIKO U, et al. Chalcones, coumarins, and flavanones from the exudate of Angelica keiskei and their chemopreventive effects[J]. Cancer Letters, 2003, 201(2): 133-137. DOI:10.1016/S0304-3835(03)00466-X.

[8] 刘畅, 王正武, 吴金鸿. 药食兼用植物明日叶的研究进展及应用[J].食品与药品, 2013, 15(3): 205-209. DOI:10.3969/j.issn.1672-979X.2013.03.022.

[9] 杨玲娟, 焦成瑾, 高二全. 三七中三七素及其异构体的高效液相色谱检测[J]. 中药材, 2015, 38(2): 311-314. DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2015.02.026.

[10] DAEWOOK K, MARCUS J, CURTIS L. Quantitative analysis of phenolic metabolites from different parts of Angelica keiskei by HPLC-ESI MS/MS and their xanthine oxidase inhibition[J]. Food Chemistry, 2014, 153: 20-27. DOI:10.1016/j.foodchem.2013.12.026.

[11] 侯璐, 钱和. 高效液相色谱法测定刺梨中维生素C的含量[ J ] .食品工业科技, 2 0 0 9 , 3 0 ( 8 ) : 3 1 1 – 3 1 3 . D O I : 1 0 . 1 3 3 8 6 /j.issn1002-0306.2009.08.077.

[12] KYUICHI K, KEISUKE S, KAZUNORI L, et al. Prenylated chalcones 4-hydroxyderricin and xanthoangelol stimulate glucose uptake in skeletal muscle cells by inducing GLUT4 translocation[J]. Molecular Nutrition and Food Research, 2011, 55(3): 467-475. DOI:10.1002/mnfr.201000267.

[13] MATSUURA M, KIMURA Y, NAKATA K. Artery relaxation by chalcones isolated from the roots of Angelica keiskei[J]. Planta Medice, 2001, 67(3): 230-235. DOI:10.1055/s-2001-12011.

[14] 郭晓青, 吴金鸿, 刘畅, 等. 明日叶的茎与叶主要抗氧化成分含量及抗氧化性比较[J]. 食品与发酵工业, 2013, 39(8): 122-127.DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.2013.08.003.

[15] 李法庆, 刘东峰. 一种从明日叶中提取4-羟基德里辛的方法: 中国, 2011102186938[P/OL]. [2013-02-06]. https://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action.

[16] 中山策敏, 滕秀兰. 一种明日叶中查尔酮类成分的提取工艺: 中国, 2010102991890[P/OL]. [2011-04-20]. https://epub.sipo.gov.cn/patentoutline.action.

[17] KIMURA Y, TANIGUCHI M, BABA K. Antitumor and antimetastatic activities of 4-hydroxyderricin isolated from Angelica keiskei roots[J]. Planta Medica, 2004, 70(3): 211-219. DOI:10.1055/s-2004-815537.

[18] YOSHIYUKI K, KIMIYE B. Antitumor and antimetastatic activities of Angelica keiskei roots, part 1: isolation of an active substance, xanthoangelol[J]. International Journal of Cancer, 2003, 106(3): 429-437. DOI:10.1002/ijc.11256.

[19] 宁鸿珍, 陈欣华, 王曼曼, 等. 超声波辅助提取明日叶查尔酮的工艺优化[J]. 食品研究与开发, 2014, 35(8): 34-37. DOI:10.3969/j.issn.1005-6521.2014.08.1.

[20] 尹慧丹, 田大永, 方波. 微波辅助提取明月草叶查尔酮工艺研究[J].食品工业, 2011, 32(11): 43-46.

[21] 徐怀德. 天然产物提取工艺学[M]. 北京: 中国轻工业出版社, 2011: 348.

[22] TOSHIHIRO A, HARUKUNI T, DAISUKE H, et al. Chalcones and other compounds from the exudates of Angelica keiskei and their cancer chemopreventive effects[J]. Journal of Natural Products, 2006, 69(1): 38-42. DOI:10.1021/np058080d.

[23] LEI L, GIANCARLO A, MARINA C, et al. Characterisation, extraction efficiency, stability and antioxidant activity of phytonutrients in Angelica keiskei[J]. Food Chemistry, 2009, 115(1):227-232. DOI:10.1016/j.foodchem.2008.12.015.