HPLC-PDA法测定明日叶不同部位中的4-羟基德里辛和黄色当归醇含量

作者单位:

  • 上海海洋大学食品学院,上海
  • 上海市园林科学研究所,上海
  • 宜宾学院化学与化工学院,四川 宜宾
  • 上海交通大学农业与生物学院,上海

摘     要

采用高效液相色谱配备光电二极管阵列检测器法测定明日叶根、茎和叶中4 – 羟基德里辛(4-hydroxyderricin,4-HD)和黄色当归醇(xanthoangelol,XAG)的含量。样品分析选用Halo C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm),流动相为0.1%甲酸(A)-甲醇(B)溶液,梯度洗脱,流速为0.3 mL/min,检测波长为370 nm,柱温为40 ℃。4-HD、XAG在0.945~18.900、1.048~20.960 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好,样品含量的相对标准偏差分别为3.13%、2.52%,方法的重复性好,平均回收率分别为103.70%、103.05%。

经检测明日叶中4-HD的分布规律为:茎(149.16 μg/g)>根(122.42 μg/g)>叶(1.24 μg/g);XAG的分布规律为:根(144.28 μg/g)>茎(75.17 μg/g)>叶(1.21 μg/g)。4-HD和XAG在根和茎中的分布显著高于其在叶中的分布。

关键词:明日叶;4-羟基德里辛;黄色当归醇;高效液相色谱配备光电二极管阵列检测器

英文摘要(Abstract)

Determination of 4-Hydroxyderricin and Xanthoangelol in Different Parts of Angelica keiskei by HPLC-PDA

(College of Food Science and Technology, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China;Shanghai Institute of Landscape Gardening Science, Shanghai 200232, China;College of Chemistry and Chemical Engineering, Yibin University, Yibin 644000, China;School of Agriculture and Biology, Shanghai Jiaotong University, Shanghai 200240, China)

Abstract: In this study, the contents of 4-hydroxyderricin (4-HD) and xanthoangelol (XAG) in roots, stems and leaves of Angelica keiskei were determined using high performance liquid chromatography with photo-diode array (HPLC-PDA) detector. The samples were separated on a Halo C18-column (4.6 mm × 150 mm, 2.7 μm), gradiently eluted with 0.1% formic acid in water (A) and methanol (B) at a flow rate of 0.3 mL/min and detected at 370 nm. The column temperature was set at 40 ℃. Good linear relationships between peak area and injection amount of 4-HD and XAG were established within the range of 0.945–18.900 and 1.048–20.960 μg/mL, respectively. The relative standard deviations (RSDs) of peak area for the two compounds were 3.13% and 2.52%, respectively, suggesting good reproducibility of the developed method. The average recoveries of the spiked compounds were 103.70%, and 103.05%, respectively.

The results showed that the distribution of 4-HD in different parts of Angelica keiskei was ranked in decreasing order as follows: stems (149.16 μg/g) > roots (122.42 μg/g) > leaves (1.24 μg/g), while the order of XAG content was as follows: roots (144.28 μg/g) > stems (75.17 μg/g) > leaves (1.21 μg/g). The contents of 4-HD and XAG in roots and stems of Angelica keiskei were significantly higher than in leaves.

Key words: Angelica keiskei; 4-hydroxyderricin (4-HD); xanthoangelol (XAG); high performance liquid chromatography

with photo-diode array (HPLC-PDA)

 

明日叶(Angelica keiskei)是原产于日本伊豆、八丈岛的一种药食兼用的蔬菜,属水芹科多年生草本植物,因今日采摘明日即可发芽而得名[1-3]。

20世纪90年代从日本引进我国,现在逐步发展扩大。明日叶中含有20多种具有生理活性的查尔酮、香豆素类、黄酮类物质,其中4-羟基德里辛(4-hydroxyderricin,4-HD)和黄色当归醇(xanthoangelol,XAG)是明日叶中以苷元形式存在的重要的查尔酮类物质[4-5],具有特殊的抗氧化、抗肿瘤、抗糖尿病、抗血栓等多种生物活性和药用价值,在植物中非常罕见,其化学结构式如图1所示[6-8]。

植物中不同次生代谢产物的分布和积累是有差异的,了解植物体内有效成分含量的分布对药用植物的栽培、采收及开发可以提供指导[9]。然而目前关于明日叶中活性成分4-HD和XAG在明日叶中不同部位(根、茎和叶)的含量差异分析鲜见报道。

4-羟基德里辛和黄色当归醇的化学结构式

图 1 4-羟基德里辛和黄色当归醇的化学结构式
Fig.1 Chemical structures of 4-hydroxyderricin and xanthoangelol

本实验采用高效液相色谱配备光电二极管阵列(high performance liquid chromatography with photo-diode array,HPLC-PDA)法测定明日叶根、茎、叶3 个部位中4-HD和XAG的含量,为明日叶的开发和利用提供数据基础[10-11]。

 

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

明日叶,采自上海交通大学七宝校区明日叶种植基地,采集时间为2014年11月。样品分装后在-20 ℃条件下保存。

4-HD和XAG标准品(纯度均大于98%) 中国科学院上海药物研究所天然产物化学研究室;甲醇(色谱纯) 国药集团化学试剂有限公司;其他溶剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

HPLC仪(PDA检测器及Chromquest色谱工作检测站) 美国Thermo Fisher Surveyor公司;Scout-SE型电子天平 奥豪斯仪器常州有限公司;DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱 上海精宏实验设备有限公司;BCD-189JB-S型冰箱 上海夏普电器有限公司;KQ5200DE型数控超声波清洗器 昆山市超声仪器有限公司;HH-S型数显恒温水浴锅 金坛市岸头国瑞实验仪器厂;TGL-16M高速台式离心机 上海卢湘仪器有限公司;FD-1A-50型冷冻干燥机 北京博医康实验仪器有限公司;HK-02A型100 g手提式粉粹机 广州旭朗机械设备有限公司;RE-52C型旋转蒸发器水浴槽 上海青浦沪西仪器厂;DC-2006型低温恒温槽 上海比朗仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 对照品溶液制备

准确称取4-HD、XAG各0.945、1.048 mg,分别置于5 mL容量瓶,加甲醇至刻度,超声溶解得对照品储备液。各吸取1 mL对照品储备液,配成混合对照品储备液。分别准确吸取混合对照品储备液200、150、100、50、10 μL置于1 mL容量瓶中,加甲醇定容,摇匀,配制成一系列混合对照品工作溶液[12]。

1.3.2 供试品溶液制备

明日叶清洗干净,剪切分为叶子、茎干、树根3 个部分,置于-4 ℃条件下冷冻24 h,然后真空冷冻干燥22 h,粉碎,过100 目筛[13-14],得到干燥粉末。按1∶10(g/mL)将样品粉末与体积分数50%乙醇溶液混合,37 ℃水浴加热浸取3 h,冷却到室温,收集乙醇浸取液,按上述方法再浸取样品一次,合并的乙醇浸取液减压回收,至无醇味得到流浸膏。加入8 倍流浸膏质量的去离子水,乙酸乙酯萃取水溶液中目标物质,直至乙酸乙酯萃取液近于无色。合并乙酸乙酯溶液于圆底烧瓶中,在31 ℃、0.1 MPa条件下进行旋转蒸发去除乙酸乙酯,即得样品粗品,保存备用[15-18]。

用甲醇将适量的样品粗品定容至1 mL,超声混匀,过0.45 μm滤膜,备用。

1.3.3 色谱条件

Halo C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,2.7 μm);流动相:0.1%甲酸溶液(A)-甲醇(B),梯度洗脱程序如下:0~2 min,30% A;2~40 min,30~0% A;40~45 min,0% A;45.0~45.1 min,0~30% A;45.1~50.0 min,30% A。流速0.3 mL/min;柱温40 ℃;检测波长370 nm;进样量5 μL;检测时间50 min。

1.3.4 HPLC-PDA方法学考察

1.3.4.1 精密度实验

精密吸取混合对照品工作溶液(C4-HD=9.45 μg/mL、CXAG=10.48 μg/mL)5 μL,重复进样5 次,分别得到5 个峰面积,进行精密度实验测定。

1.3.4.2 重复性实验

取样品6 份,照1.3.2节方法平行制备,分别进样测定,计算重复性。

1.3.4.3 加样回收率实验

精密称取已知含量的样品适量共5 份, 分别加入混合对照品储备液(C4-HD=94.5 μg/mL、CXAG=104.8 μg/mL)100 μL,按供试品溶液的测定方法处理,测定峰面积,分别计算加样回收率。

1.3.5 样品含量测定

根据4-HD和XAG的HPLC色谱峰面积,依据下式分别可以算出样品中4-HD和XAG的含量。

明日叶成份测量公式

式中:A为4-HD或XAG的含量/(μg/g);C样为根据标准曲线得出的被测样品中4-HD或XAG的质量浓度/(μg/mL);V定为样品最终定容体积/mL;M为试样质量/g;F为稀释倍数。

 

2 结果与分析

2.1 检测波长的选择

对4-HD和XAG的混合对照品储备液在HPLC-PDA中进行分离并且扫描,在波长370 nm处有最大吸收显示,故本实验以370 nm作为扫描波长。

2.2 样品溶剂的选择

提取溶剂一般有甲醇、乙醇、正己烷等,但是甲醇、正己烷等对人体有害。乙醇可有效降低查尔酮酶的活性[19-21],故选择体积分数50%乙醇溶液作为第1步的萃取剂。根据水沉原理,利用体积分数50%乙醇溶液,可减少提取液中淀粉、蛋白质、黏质等成分的浸入,回收

乙醇后,加水静置处理,可除去溶液中的树脂、脂溶性色素,除去杂质及沉淀[22]。目标物的极性较小,根据相似相容原理,故用乙酸乙酯从溶液中萃取目标物[23]。

2.3 HPLC-PDA方法学考察结果

按照1.3.4节实验方法测定,分别可得4-HD峰面积的相对标准偏差(relative standard deviation,RSD)为0.85%,XAG峰面积的RSD为0.93%,表明该方法精密度良好;4-HD含量的RSD为3.13%,XAG含量的RSD为2.52%,表明重复性良好;4-HD的平均回收率为103.70%,XAG的平均回收率为103.05%,RSD均小于2%。说明本实验中的HPLC-PDA方法完全适用于样品的测定。

2.4 线性关系分析

将1.3.1节制备的一系列混合对照品工作溶液,在1.3.3节所述色谱条件下进行峰面积测定,以质量浓度C(μg/mL)为横坐标(X),峰面积S为纵坐标(Y)进行线性回归分析,绘制标准品的标准曲线。4-HD的回归方程为Y=305 439X+1 417 954,R2=0.999 2;XAG的回归方程为Y=288 515X+1 492 839,R2=0.999 3。

结果表明4-HD、XAG在0.945~18.900、1.048~20.960 μg/mL质量浓度范围内线性关系良好。混合对照品工作溶液(C4-HD=9.450 μg/mL、CXAG=10.480 μg/mL)色谱图见图2,4-HD和XAG 2 个峰之间的分离度为1.8,表明本实验的色谱条件完全适用于4-HD和XAG的分离和检测,且分离效果良好。

混合对照品工作溶液HPLC色谱图

图 2 混合对照品工作溶液HPLC色谱图
Fig.2 HPLC chromatogram of standard mixture

图 2   混合对照品工作溶液HPLC色谱图

Fig.2   HPLC chromatogram of standard mixture

2.5 样品中4-HD和XAG的含量测定

按1.3.3节所述色谱条件进行供试品溶液的测定,在波长370 nm处记录明日根、茎、叶的HPLC图,见图3。

明日叶样品HPLC色谱图 明日叶样品HPLC色谱图 明日叶样品HPLC色谱图

(A.明日叶根提取物;B.明日叶茎提取物;C.明日叶叶提取物)

图 3   明日叶样品HPLC色谱图

Fig.3   HPLC chromatograms of Angelica keiskei extracts

 

计算样品中4-HD和XAG含量,并对含量进行对比分析,明日叶不同部位中4-HD和XAG的含量测定结果见表1。

表 1 明日叶不同部位中4-HD和XAG的含量

Table 1 Contents of 4-HD and XAG in different parts of Angelica keiskei

部位 4-HD含量/(μg/g) XAG含量/(μg/g)
1.24±0.04 1.21±0.03
149.16±3.94 75.17±2.12
122.42±3.84 144.28±3.56

 

2.6 不同部位4-HD和XAG含量比较

明日叶各部位均含有4-HD和XAG,且各部位之间差异较大,4-HD主要分布在茎中。明日叶各部位4-HD的含量依次为:茎(149.16 μg/g)>根(122.42 μg/g)>叶(1.24 μg/g)。根、茎与叶这3 个部位之间4-HD的含量差异显著。茎中4-HD的含量最高,是根、叶含量的1.2~120.3 倍。

明日叶中X A G 含量的分布规律依次为: 根(144.28 μg/g)>茎(75.17 μg/g)>叶(1.21 μg/g),和4-HD的分布特点有所不同。根、茎、叶这3 个部位之间含量差异更明显,尤其根中XAG含量最高,是茎、叶的1.9~119.2 倍。

这3 个部位中,根和茎干中的4-HD和XAG的含量显著大于叶中的含量,茎干中4-HD(149.16 μg/g)的含量与根中(122.42 μg/g)的含量差值为26.74 μg/g,远小于明日叶根中XAG(144.28 μg/g)的含量与茎干(75.17 μg/g)的差值69.11 μg/g。且明日叶根中4-HD和XAG的含量都比较高,故从经济实际角度考虑,明日叶根比茎干在提取、利用4-HD和XAG方面更具有利用价值。

 

3 结 论

本实验在流动相为体积分数0.1%甲酸溶液和甲醇溶液,梯度洗脱、流速为0.3 mL/min、检测波长为370 nm、柱温为40 ℃的HPLC条件下,考察了明日叶植株不同部位(根、茎和叶)中4-HD和XAG含量分布情况。4-HD和XAG在明日叶的根部和茎部分含量较高,而其在叶片部分含量很低。

4-HD在茎部的含量大于根部,但两者之间的差异性不大,XAG在根部的含量明显大于其茎部,相比而言,根中4-HD和XAG这2 种物质含量都较高,更有实际利用价值。这表明明日叶植株不同部位的4-HD和XAG的代谢累积不均匀,具有部位选择性。该研究将对明日叶的不同部位合理开发利用提供理论依据。

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